作者：Rosa Vanyan, Nataliya Dolgushina, Andrey Donnikov, Ekaterina Shubina, Natalia Usman*, Maria Kuznetsova and Gennady Sukhikh
俄羅斯聯(lián)邦衛(wèi)生部產(chǎn)科、婦科和圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究中心
方法：共150名患者(65名卵巢響應(yīng)性較差的女性作為實驗組，85名正常卵巢的婦
女作為對照組)參加了這項回顧性病例對照研究。所有患者均按照卵泡刺激素和促性腺激素釋放激素拮抗劑的標準使用方法給予卵巢刺激?；蚍中褪峭ㄟ^聚合酶鏈
反應(yīng)及后續(xù)讀取熔化曲線而得出的。統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，百分比值利用χ2測試檢驗，關(guān)聯(lián)性利用比值比計算。
不良卵巢反應(yīng)(POR)是一個術(shù)語，表示在促性腺激素刺激過程中通過超聲發(fā)現(xiàn)正在生長的卵泡數(shù)量減少(在這里并不涉及潛在的功能性問題，那將是另外一個 主題)。根據(jù)歐洲人類生殖和胚胎學(xué)會對POR定義的共識(博洛尼亞標準)，POR必須同時滿足以下三個特征中至少兩點：(一)高齡產(chǎn)婦(≥40歲)或任何 其他具體的風(fēng)險因素，(ii)使用常規(guī)卵巢刺激方案只能得到≤3卵母細胞，及(Ⅲ)卵巢儲備功能測試異常(ORT;即竇狀卵泡計數(shù)少(AFC;小于 5–7)或血液中抗苗勒氏管激素水平低(AMH;< 0.5–1.1納克/毫升))。例如，40歲以上并且有ORT異常的患者可以被分類為不良卵巢響應(yīng)者(或預(yù)期POR);另一方面，如果一個患者有兩次在接 受較大刺激后仍有不良卵巢響應(yīng)的經(jīng)歷，則不論她是否高齡產(chǎn)婦或者是否有ORT異常，也可確診該患者為POR [ 1 ]。在文獻中POR出現(xiàn)的比率在9%至24%之間;此外，POR導(dǎo)致了50%被中止的IVF療程，并且是更主要的降低IVF妊娠率的因素[ 2 ]。
共有150名患者(65名POR女性和85名有正常卵巢反應(yīng)女性為對照組)參與了此回顧性病例對照研究。所有這些人都是從2012年9月到2014年8 月間在本產(chǎn)科、婦科和圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究中心附屬醫(yī)院接受IVF治療時被招募的。招募標準為：年齡在40歲以下，正常染色體核型、兩側(cè)卵巢完整，及無卵巢手術(shù)或 盆腔放射治療史。因此，我們排除了總危險因素(第一位是年齡)，所以沒有一個病人是受上述博洛尼亞標準第一條限制的。這一步很重要，因為BMP15基因僅 在發(fā)育中的卵母細胞中體現(xiàn)，在體內(nèi)其它細胞中幾乎沒有體現(xiàn)，因此這么做可以將卵巢中一些病理過程作為本研究的中心，同時可以避免研究受到那些年齡導(dǎo)致的主 要器質(zhì)性改變的影響。所有患者都簽署了書面知情同意書，本實驗被產(chǎn)科、婦科和圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究中心的公共審查委員會所批準。
結(jié)果
在對 照組與POR實驗組之間并無有關(guān)發(fā)病率和生育史的顯著差異，但是POR組的患者比對照組的平均年齡要高(分別是34.7±3.9與 31.9±3.9，P<0.05，表1)并且有較長不孕不育的歷史，以及較高的FSH水平和較低的AMH水平。超聲檢查發(fā)現(xiàn)與對照組相比，POR組 的女性大多都有卵巢儲備功能較低的情況(卵巢體積減小和AFC≤5–7)(表1)。
參數(shù)POR組(n=65)對照組(n=85)p值
年齡(歲)34.7±3.931.9±3.9<0.0001
不孕歷史(年)7.06±3.85.4±3.60.0078
FSH水平(IU/毫升)8.6±3.46.7±2.2<0.0001
AMH水平(IU/毫升)0.64±0.522.29±1.90<0.0001
顯示低卵巢儲備功能的樣本數(shù)(人)53(81.5%)8(9.4%)<0.0001
懷孕數(shù)(人)12(18.5%)31(36.5%)0.0156
活胎數(shù)(人)8(12.3%)25(29.4%)0.0122
表1. 該表對比了不同實驗組的年齡、激素水平、患者IVF周期的結(jié)果等。POR組比對照組年齡更大，并且有更長的不孕歷史，及更高的FSH水平和更低的AMH水平。
七個BMP15 SNP等位基因出現(xiàn)的頻率在表2中給出，非主要等位基因出現(xiàn)的頻率范圍從0.007到0.526。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)POR與一個外顯子SNP (rs41308602)相關(guān)(c.308 A>G;該稀有G等位基因在POR組顯著富集：POR組有三例該SNP的雜合性樣本，而對照組沒有發(fā)現(xiàn)該SNP，P<0.05;表3)。此外，POR也可能與SNP( rs3897937)有關(guān)(c.328 + 905 A> G;POR組中G等位基因出現(xiàn)的比例有所上升：POR為0.62，對照組為0.46，P≈0.05;表
3)。POR組中總共出現(xiàn)c.308G及c.328 + 905G的頻率比對照組高了2.6±0.1倍，而其他已知SNP在兩組間出現(xiàn)的頻率并沒有顯著差異。
SNP位置NCBI(38.1)位置氨基酸替換核苷酸替換等位基因出現(xiàn)頻率
rs41308602外顯子段150911091Asn103Serc.308A>G0.020
rs138281369外顯子段150910829Val16Metc.46G>A0.020
rs104894767外顯子段250915966Ala180Thrc.538G>A0.013
rs104894763外顯子段150910985Arg68Trpc.202C>T0.007
rs3897937內(nèi)顯子段150912016 c.328+905A>G0.526
rs796052131外顯子段250916035Leu203Leuc.607C>T0.020
rs796052132外顯子段150910775 c.-8delC0.040
表2. BMP15相關(guān)SNP的詳細參數(shù)。
其中較下面的兩個為本文章新發(fā)現(xiàn)的SNP，剩余SNP曾經(jīng)出現(xiàn)在其它文獻中。
外顯子測序?qū)嶒灲沂玖藘蓚€新的BMP15 SNP并被提交給了ClinVar數(shù)據(jù)庫進行注冊。它們分別是c.607 C>T(rs796052131)和C.-8單堿基缺(rs796052132)。其中，c.607 C>T替代僅在對照組中發(fā)現(xiàn)，因此它可能與保護卵巢功能有關(guān)。相比之下，在5’非編碼區(qū)新發(fā)現(xiàn)的C.-8 delC單堿基缺失在POR組中較常見(表3)。
SNP等位基因出現(xiàn)機率等位基因χ2p值
POR(n=65)對照組(n=85)
rs413086020.046(n=3)04.0030.0454
rs1382813690.015(n=1)0.023(n=2)0.1240.7240
rs1048947670.015(n=1)0.011(n=1)0.0360.8481
rs1048947630.015(n=1)01.3160.2512
rs38979370.615(n=40)0.459(n=39)3.6210.0570
rs79605213100.035(n=3)2.3400.1260
rs7960521320.061(n=4)0.023(n=2)1.3850.2391
表3.新發(fā)現(xiàn)的變種rs796052131僅表達在對照組中，因此可能與保護卵巢功能有關(guān)。
與此相反，rs796052132則在POR組中出現(xiàn)的頻率更高。
本實驗還對rs41308602、rs3897937、rs104894763、rs138281369、rs104894767、和新發(fā)現(xiàn)的 rs796052131做了單倍型分析(都映射到BMP15外顯子1或2，或其附近)。數(shù)據(jù)顯示，在POR組中有可能發(fā)現(xiàn)該單倍型變體的幾率比對照組高 2.7倍(表4)。鑒于曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)在卵巢刺激中rs3810682 / rs3897937單倍型與上升的卵泡數(shù)(≥12)有關(guān)[ 17 ]，我們也檢查了三種常見SNP映射到外顯子1或其附近的組合單倍型概率(rs41308602，rs104894763，和rs3897937)。同樣 的，POR組的比值比高于對照組(表4)。
單倍型POR(n=65)對照組(n=85)比值比(95%置信區(qū)間)
rs41308602;rs138281369
rs104894767;rs104894763
rs3897937;rs796052131
0.7670.5502.7(1.25;5.96)
rs41308602;rs104894763
rs38979370.6760.4582.47(1.20;5.14)
表4. 變種相關(guān)的單倍型在POR和對照組出現(xiàn)的總機率。
討論
結(jié)果表明，POR與兩已知的BMP15變種有關(guān)聯(lián)性：外顯子SNP rs41308602(c.308A>G)和內(nèi)顯子SNP rs38979307(c.328 +905A>G)。c.308A>G替代導(dǎo)致相關(guān)蛋白103位點由蛋白絲氨酸變化為天冬酰胺。根據(jù)文獻，在閉經(jīng)患者和健康女性中都可以發(fā)現(xiàn)該G等位基因，但在閉經(jīng)患者中的c.308 G更經(jīng)常與G(c. - 9C > G)或T(c.852C >T)結(jié)合[ 18 ]。
c.328 +905A>G與卵巢功能的關(guān)系是有爭議的。Hanevik等[ 19 ]發(fā)現(xiàn)POR樣本中有更高頻率的G等位基因，而Mendoza等[ 20 ]則發(fā)現(xiàn)攜帶有G等位基因及其它幾個與卵巢老化相關(guān)的基因標記的女性會有更短的可生育期。Moron等[17]發(fā)現(xiàn)在對卵巢刺激有更高響應(yīng)的患者中(包括卵巢過度刺激綜合征的患者)，會有更高的幾率出現(xiàn)c.673C>T、c.328 +905A>G和c.-9С>G的TGG單倍型。Gonzalez等[ 21 ]認為相比AA基因型而言，AG基因型可能起到保護作用并防止排卵障礙和不孕癥。
與已發(fā)表的數(shù)據(jù)所預(yù)計的相反，在本研究中，三個其他已知的SNP與POR沒有關(guān)聯(lián)。比如，Di Pasquale等通過一個大的隊列研究 [ 22 ]展示了卵巢早衰表型與兩個BMP15變種有關(guān)聯(lián)：c.202C>T→p.Arg68Trp及c.538G>A→p.Ala180Thr。盡管Ledig等[ 23 ]將c.538G>A歸為多態(tài)性而非突變，他們在卵巢早衰患者和對照組中都發(fā)現(xiàn)了該變種。然而，C.538G/A雜合子比例在卵巢早衰患者中有所增加，并在幾項研究中得到進一步證實[ 10,18 ]。在我們的實驗中，兩組患者中都發(fā)現(xiàn)了這些雜合子，表明G等位基因與POR無關(guān)。但是由于該實驗采用了較小的樣本數(shù)，該結(jié)論需要更多實驗來驗證。
只在對照組出現(xiàn)的的新變種c.607T沒有氨基酸替代(對應(yīng)亮氨酸的CTA改為同義的TTA)。總體而言，這些密碼子在人類基因組上出現(xiàn)的頻率大致相同 (約為每個人7%的亮氨酸基因總數(shù))。不過，在卵巢中TTA特定的tRNA比CTA特定的tRNA更豐富[24]，且c.607C>T替代可能增加 局部BMP15 mRNA的翻譯速率，從而影響蛋白生成。我們發(fā)現(xiàn)的新單堿基缺失變種c.-8 delC在POR組中比對照組更常見，并且位于BMP15 mRNA位點42的5’非翻譯區(qū)。 它不干擾閱讀框，但可能影響翻譯的初始步驟。
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